ルミネ新宿2の独自性を決定づけている最大の要素が、7階に居を構える東日本最大規模のお笑い常設劇場「ルミネtheよしもと」です。総座席数は約458席を誇り、テレビや賞レースで活躍する人気芸人の漫才やコント、劇団員による新喜劇が365日休みなく上演されています。
劇場ロビーにはチケットを持っていなくても立ち寄れる「よしもとエンタメショップ」が併設されており、限定グッズやお笑い芸人コラボのお菓子、オリジナル文具などを買い求める観光客やファンで常に熱気を帯びています。劇場の関係者によると、平日公演は近隣のオフィスワーカーや遠方からの観光客、休日はファミリー層やカップルなど幅広い世代が客席を埋めており、リピート率の高さが館全体の回遊性を底上げしています。
観劇を楽しむ際の注意点として挙げられるのが、開場前後のエレベーター混雑です。ルミネ新宿2のエレベーターは複数基稼働しているものの、公演の入れ替え時間帯（特に土日祝の昼公演前後）は7階へ向かう直通客で1階エレベーターホールに長い行列が生じます。開演の15〜20分前には南口エントランスへ到着し、時間に余裕を持って上層階へ移動するのが現場目線での推奨ルートです。
