『ピタゴラスイッチ』の人形劇には、ペンギン兄弟以外にも強烈な個性と魅力を持ったキャラクターたちが多数登場します。いずれも番組の教育的テーマを楽しく伝えるための重要な役割を担っています。
番組を彩る主要キャラクターの一覧と、それぞれの特徴は以下の通りです。
ネズミのスー（声：山田栄子）
ピタとゴラの頼れる相棒。自分で作った小さな台車やミニカーを華麗に乗りこなし、手紙や重い荷物をテキパキと運ぶ働き者です。言葉を話すことはなく「チュッ」という鳴き声のみですが、意思疎通は完璧で、番組内でも屈指の有能さを誇ります。声を担当するのは『赤毛のアン』のアン役などで名高いベテラン声優の山田栄子です。
百科おじさん（声：二代目 中村吉右衛門）
ペンギン兄弟が分からないことに直面した際、頼りにする百科事典のキャラクター。本名は「ペン・ジャミン」。物知りですが、最新の流行語など自分のページに載っていない質問をされると「と、いうことはじゃな……」とごまかそうとするお茶目な一面があります。声を演じたのは歌舞伎界の人間国宝・二代目中村吉右衛門であり、その重厚で温かみのある美声が世界観に深い品格を与えました。
テレビのジョン（声：井上順）
ブラウン管テレビの形をした犬のキャラクター。ピタやゴラたちに様々な映像コーナーを紹介する案内役を務めます。タレント・俳優の井上順による軽快で親しみやすい語り口が特徴です。
ディック（声：春風亭昇太）
百科おじさんの甥にあたる英語辞典のキャラクター。落語家の春風亭昇太が声を担当し、明るく快活なアクセントを劇中に加えています。
