眠らない街・上野の夜を支えるドンキホーテ上野店の最大の特徴は、年中無休の24時間営業体制を維持している点にあります。夜間の急な買い出しはもちろん、観光客の早朝アクティビティ前やお仕事帰りの遅い時間帯でも、いつでも同じ活気で迎え入れてくれます。
深夜営業を行っている商業施設が限られる文京・台東エリアにおいて、終電を逃した際の駆け込み寺としても重宝されています。ただし、第1類医薬品などの一部カウンター商品に関しては、薬剤師の勤務時間帯（主に日中〜夕方）のみの販売となるケースがあるため、特定の医薬品を目的とする場合は日中の来店が確実です。
